Chapitre 4.10.

Collecte et manipulation
des ovules/embryons de rongeurs
et de lapins de laboratoire

Article 4.10.1.

L'entretien de colonies d'animaux de laboratoire de génotypes particuliers exige des méthodes d'élevage rigoureuses dans des locaux spécialisés. Les animaux peuvent être entretenus dans un milieu gnotobiotique, que ce soit un système exempt de germes ou une enceinte de confinement (généralement avec une flore définie), dans une colonie ordinaire ou dans des conditions non définies. Dans les systèmes d'élevage exempts de germes et en enceinte de confinement, les animaux sont élevés dans un milieu contrôlé grâce à des protocoles qui visent à éliminer toute source potentielle de contamination microbienne. La différence principale entre ces deux systèmes est que les animaux maintenus confinés ont été inoculés avec des germes connus (définis)¹ en utilisant une association d'une flore non pathogène, alors que les animaux gnotobiotiques sont protégés aussi bien des germes pathogènes que des germes non pathogènes.

Les animaux de laboratoire peuvent aussi être entretenus dans des colonies ordinaires fermées, où des agents pathogènes connus peuvent être présents. Des protocoles de gestion moins stricts sont appliqués pour contrôler les sources potentielles de contamination, mais le recours à de simples précautions d'asepsie (telles que l'autoclavage des aliments et des litières) devrait permettre de maintenir les animaux dans une ambiance microbienne définie. Les animaux de laboratoire peuvent aussi se trouver dans des milieux dont le statut microbien n'est pas défini (colonies non isolées, animaux élevés en liberté).

On peut donc considérer que le dépistage des maladies et les obligations applicables à la manipulation des femelles donneuses et des embryons sont de trois types différents selon la colonie considérée : colonie à flore définie, colonie ordinaire ou colonie à statut indéfini. L'état sanitaire de toutes les colonies doit être contrôlé trimestriellement par des épreuves bactériologiques, virologiques, parasitologiques, sérologiques et immunohistochimiques portant sur des animaux sentinelles préalablement sélectionnés à cet effet ou sur d'autres animaux représentatifs de la colonie (mâles reproducteurs âgés dont sont issues plusieurs portées, par exemple).

Article 4.10.2.

1. L'équipe de production des embryons doit être composée de techniciens compétents travaillant sous la direction d'un embryologue expérimenté, détenteur d'un diplôme universitaire (maîtrise de science, doctorat es science ou doctorat en médecine vétérinaire, par exemple).

2. Le personnel de l'équipe doit être formé aux principes de la prophylaxie des maladies et à l'utilisation des techniques d'asepsie pour la manipulation des embryons. Les protocoles sanitaires du laboratoire doivent être conformes au Manuel de l'IETS².

3. L'équipe de production des embryons doit prendre toutes les précautions nécessaires pour protéger les installations d'élevage, le laboratoire et le matériel contre les contaminations microbiennes. La possibilité qu'ont certains agents pathogènes d'occasionner des zoonoses doit notamment être précisée et bien comprise par tous les membres du personnel afin d'éviter la contamination des colonies par des vecteurs humains (et réciproquement). Des dispositions doivent être prises pour empêcher le personnel ayant pénétré dans d'autres locaux d'accéder librement au laboratoire de manipulation des embryons.

4. L'embryologue responsable doit tenir à jour des dossiers en bonne et due forme pour être en mesure de les présenter lors d'une inspection éventuelle.

   Tant que des fiches standard n'auront pas été mises au point spécifiquement pour les animaux de laboratoire, il appartiendra à chaque laboratoire de tenir des dossiers complets sur les animaux et les embryons (collecte des embryons, données sur la congélation). Il conviendra d'y ajouter, le cas échéant, des informations du type de celles prévues sur les fiches standard de l'IETS² pour les animaux d'élevage. Les données portant notamment sur le système d'évaluation de la qualité des embryons, le stade de développement morphologique au moment de la congélation et l'identification du génotype des femelles donneuses doivent aussi être consignés clairement dans les dossiers.

5. Il appartient à l'embryologue responsable (chargé de superviser le laboratoire) de veiller à ce que les embryons soient conservés comme il convient dans des récipients stériles et scellés (ampoules ou paillettes, par exemple). Ces récipients doivent être dûment étiquetés selon un système normalisé précisant l'espèce/le génotype de l'embryon, la date de cryoconservation, le nombre d'embryons et leur stade de développement, le numéro du récipient ainsi que toute procédure spécifique utilisée (fécondation in vitro ou micromanipulation, par exemple) ou toute caractéristique particulière (embryons gnotobiotiques ou à statut microbien défini).

Article 4.10.3.

1. Le vétérinaire, spécialisé dans les soins aux animaux de laboratoire ou agréé à cet effet, doit veiller à ce que les protocoles de mise en conformité sanitaire propres aux colonies soient effectivement appliqués et à ce que leurs résultats soient contrôlés et correctement consignés par écrit avant l'expédition des embryons. Il est également chargé d'attester que les conditions d'élevage et d'hygiène appropriées ont été respectées.

2. Le vétérinaire est chargé de certifier que les procédures de manipulation des embryons et les conditions de travail au laboratoire ont été conduites en conformité avec celles définies dans le Manuel de l'IETS².

3. Il est également chargé du contrôle de toutes les mesures de quarantaine visant à éviter les contaminations indésirables et la propagation des maladies ainsi qu'à assurer la validité des résultats obtenus.

4. Le vétérinaire doit délivrer son autorisation pour toutes les expéditions d'embryons et veiller à ce que les documents de certification sanitaire et les dossiers de collecte des embryons soient correctement remplis et accompagnent les lots expédiés.

Article 4.10.4.

Dans chaque colonie de femelles donneuses, des animaux sentinelles doivent être systématiquement soumis à des examens microbiologiques mensuels. La recherche d'agents pathogènes particuliers varie selon l'espèce et certainement aussi en fonction de l'endroit considéré. Des recommandations portant sur les germes microbiens spécifiques à rechercher chez les souris, les rats, les sigmodons, les hamsters, les cobayes, les gerbilles et les lapins ont été publiées par ailleurs³.

Article 4.10.5.

1. Situation où la flore microbienne est contrôlée

   1. Les animaux gnotobiotiques et ceux dont le statut microbien est défini, car maintenus dans une enceinte de confinement, représentent la source la plus « propre » de gamètes, et les embryons qui en sont issus peuvent être considérés comme exempts d'agents pathogènes.

   2. Étant donné que les animaux eux-mêmes sont exempts d'agents pathogènes ou sont porteurs d'une flore définie (généralement contrôlée par des tests mensuels aléatoires sur des animaux sentinelles), la dissection de l'appareil reproducteur et l'isolement des embryons peuvent être pratiqués dans des conditions aseptiques et ne nécessitent pas le recours à une hotte de sécurité biologique.

   3. Il convient néanmoins d'appliquer des procédures d'asepsie rigoureuses et, bien que le lavage des embryons ne soit pas essentiel pour éviter les contaminations éventuellement véhiculées par l'air dans le laboratoire, il est néanmoins recommandé de soumettre les embryons à un procédé de lavage comportant au moins trois étapes. À chaque lavage, les embryons doivent être agités délicatement dans le milieu, le volume du liquide de lavage devant représenter au minimum cent fois le volume dans lequel les embryons sont transférés.

   4. Le contrôle microbiologique du milieu de rinçage ou de lavage n'est pas nécessaire.

   5. Les dossiers doivent stipuler que les embryons conservés sous froid proviennent d'une colonie gnotobiotique ou microbiologiquement définie en enceinte de confinement, ce qui indique qu'il est inutile de prendre des mesures complémentaires pour éliminer les agents pathogènes. L'isolement et la surveillance de l'état sanitaire des femelles receveuses doivent être envisagés, mais la nécessité d'une mise en quarantaine relève de la décision du laboratoire importateur.

2. Situation ordinaire

   1. Les animaux élevés dans cette situation constituent généralement des colonies fermées dont l'état sanitaire est régulièrement déterminé. Ils peuvent avoir été exposés à différents agents pathogènes, ce qui peut conduire à l'isolement d'agents pathogènes ou à la détection d'anticorps, ou même à l'expression de signes cliniques. Avant de procéder à la collecte des embryons, il convient néanmoins de bien connaître le ou les agents pathogènes particuliers à la colonie concernée.

   2. L'appareil reproducteur (utérus, oviductes et/ou ovaires) doit être prélevé en un lieu séparé avant d'être transféré au laboratoire de collecte des embryons. Cette opération doit être réalisée par des techniciens différents de ceux du laboratoire ou, si ce n'est pas le cas, il convient à tout le moins de changer de vêtements de protection entre les deux sites. Si les animaux doivent être manipulés dans le laboratoire, les appareils reproducteurs doivent être disséqués dans une hotte de sécurité biologique, pour éviter la dissémination d'agents pathogènes dans le laboratoire.

       

   3. Après le prélèvement de l'appareil reproducteur, la collecte des embryons doit être réalisée dans des conditions aseptiques. Les embryons doivent être examinés sous un grossissement > 100 X pour rechercher la présence de fissures sur la zone pellucide. Seuls les embryons à zone pellucide intacte doivent être conservés. Ceux-ci doivent alors être lavés selon la méthode classique à dix étapes décrite dans le Manuel de l'IETS². Cette recommandation pourrait devenir sans objet si les résultats d'un nombre suffisant d'études sur les interactions entre embryons et agents pathogènes le justifiaient.

       

   4. Les embryons issus d'animaux possédant des anticorps ou présentant d'autres signes de contamination par des agents pathogènes spécifiques ne doivent être transférés dans une nouvelle colonie qu'en appliquant un système de quarantaine et en utilisant des femelles receveuses au statut microbien défini. À titre de précaution supplémentaire, les receveuses doivent être mises en quarantaine en cas de doute sur l'état sanitaire des femelles donneuses ou des embryons. Dans certaines situations où les embryons pourraient avoir été exposés à une infection bactérienne (à mycoplasmes, par exemple), ils doivent être mis en culture pendant 24 heures dans un milieu contenant un antibiotique approprié, soit avant la congélation, soit entre la décongélation et le transfert.

       

   5. Si les embryons n'ont pas été manipulés comme il est recommandé, ceci doit être indiqué sur les documents d'expédition. Les femelles receveuses et les nouveau-nés doivent alors obligatoirement être mis en quarantaine par le laboratoire receveur jusqu'à la confirmation de leur bon état sanitaire. Les agents pathogènes doivent être recherchés chez la femelle receveuse après le sevrage, et sa descendance ne doit être introduite dans la colonie que si ces résultats sont satisfaisants.

    

3. Statut microbien non défini

    

   1. Ces animaux sont d'origine sauvage ou proviennent de colonies dont l'état sanitaire est inconnu. Les embryons qui en sont issus exigent un maximum de précautions. L'état sanitaire des mâles reproducteurs et des femelles donneuses doit être contrôlé 15 jours avant ainsi que le jour même de l'accouplement (pour les mâles) ou au moment de la collecte des embryons (pour les femelles). Il est aussi possible d'introduire ces animaux dans une colonie ordinaire où il sera possible, au cours du temps, de retracer leurs antécédents sanitaires, en vue de réduire les strictes exigences relatives à leur surveillance et à la manipulation des embryons.

       

   2. Une hotte de sécurité biologique doit être utilisée pour toute manipulation d'animaux, de tissus et d'embryons.

       

   3. Une partie aliquote du liquide de rinçage provenant de chaque donneuse, ou un échantillon de mélange, doivent être analysés pour y rechercher les agents pathogènes importants pour le pays ou le laboratoire importateur.

       

   4. Les embryons doivent être lavés conformément aux protocoles figurant dans le Manuel de l'IETS² (lavage en dix étapes avec traitement éventuel à la trypsine si l'on veut éviter certains herpèsvirus). Une partie aliquote des quatre derniers liquides de lavage (mélangés) doit être contrôlée pour y détecter l'éventuelle présence d'agents pathogènes.

       

   5. Les embryons congelés doivent être conservés par le laboratoire exportateur jusqu'à l'achèvement des analyses à réaliser sur les tissus et les liquides. Tous les embryons issus de ces animaux doivent être transférés dans une colonie en utilisant le système de quarantaine précédemment décrit. En outre, des contrôles doivent être pratiqués non seulement sur les femelles receveuses mais aussi sur toute leur descendance à l'âge de 12 semaines et/ou les animaux des générations suivantes doivent être contrôlés avant d'être introduits dans des colonies de reproducteurs situées en dehors de l'installation de quarantaine.

Article 4.10.6.

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1. Recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guineapig and rabbit breeding colonies.- Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), Working Group on Animal Health accepted by the FELASA Board of Management, November (1992).

2. Manuel de la Société internationale de transfert d'embryons (1998).

3. Schiewe M.C., Hollifield V.M., Kasbohm L.A. & Schmidt P.M. (1995) - Embryo importation and cryobanking strategies for laboratory animals and wildlife species. Theriogenology, 43, 97-104.